董建达, 金洲祥，李春明
[摘要] 目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)体外对人胰腺癌 MIAPaCa-2
细胞增殖和细胞周期分布的影响。方法：采用四甲基氮唑蓝法（MTT）检测 Res
处理后MIAPaCa-2细胞的增殖情况。用流式细胞仪分析经25μmol/L、50μmol/L、
100μmol/L、200μmol/L Res分别作用 48hr 后 MIAPaCa-2 细胞周期分布的改变。
结果：Res 体外能显著抑制 MIAPaCa-2 细胞的生长增殖，且在一定范围内浓度依
赖性。Res作用后细胞 G0/G1期比例下降,S期比例上调,G2/M期未见规律性改变。
结论：Res 在体外能显著抑制 MIAPaCa-2 细胞的增殖，引起细胞周期重新分布可
能是 Res 抑制 MIAPaCa-2 细胞增殖的机制之一。
关键词: 白藜芦醇； 胰腺癌； 增殖； 细胞周期
Effect of Res on the proliferation and cell-cycle distribution of MIAPaCa-2 cells
in vitro
DONG Jian-da. Departm ent of General Surgery, The second Affiiliated Hospital,
Wenzhou M edical Collage,Wenzhou 325027, China
[Abstracts] Aim: To explore the effect of Res on the proliferation and cell-cycle
distribution of MIAPaCa-2 cells in vitro. Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium
method (MTT) was used to detect the cell growth status of MIAPaCa-2 cells after
treatment by Res. Cell cycle distribution of MIAPaCa-2 cells were analyzed by
flowcytometry(FCM) after cells were treated with 25 μmol/L, 50μmol/L, 100μmol/L
and 200μmol/L Res for 48hr, respectively. Results: Res inhibited the proliferation of
MIAPaCa-2 cells in a concentration-dependent manner as measured by MTT
method. Res decreased the percentage of cells in the G1 phase with a concomitant
increase in the proportion of cells in the S phase. Conclusions: These findings
suggest that Res may have a potent anti-proliferative effect on MIAPaCa-2 cells ,the
mechanisms of which may be related to the induction of re-distribution of cell cyle.
Key Words: Resveratrol; Pancreatic carcinoma; Proliferation; Cell-cycle
作者单位:325027 温州,温州医学院附属第二医院普通外科(董建达)
作者简介:董建达(1972- ), 男,浙江乐清人,副主任医师。E-mail:
胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道肿瘤,化疗是治疗胰腺癌最主要的辅
助手段之一，但不论是单药化疗还是联合化疗，肿瘤对化疗药物的反应率都不高
[1]。因此，胰腺癌化疗效果的根本改观有赖于新药的发现和化疗方案的改进，在
此之前能做的工作便是挖掘现有药物的潜力。白藜芦醇(resveratrol,Res)是一
种多酚类化合物，化学名为芪三酚(3,5，4'-trihydroxystibene),已在虎杖、葡
萄等 72 种植物(隶属 12 个科，32 个属)中被发现，我国中药植物虎杖鲜根中有
较高的含量 [2]。最近研究已经表明，Res 对多种肿瘤具有显著抑制作用[3-5]，有
望成为治疗肿瘤的新药。但目前关于 Res 和胰腺癌治疗方面的研究甚少。在本实
验中我们选择 Res 和胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞为研究对象，通过体外实验观察 Res
对胰腺癌细胞增殖和周期的影响，来初步探讨 Res 用于胰腺癌治疗的可能性。
材料与方法
1.细胞株与试剂
人胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞株购自湖南远泰生物公司。Res 购自美国 Sigma 公
司，纯度>99.9%，用二甲基 亚砜(dimethyl sulphoxide ，DMSO)溶解 ，配成
400μmol•L
为美国 Amresco 公司产品，处理细胞时，DMSO 浓度≤0.1%(实验证实该浓度对细
胞生长无影响)。DMEM 培养基(Dulbecco modified Eagle medium)、0.25%胰酶
为美国 GIBCO 公司产品, 碘化丙啶(propidium iodine ,PI)为美国 Sigma 公司产
品。
2.细胞培养
人胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞在 5%CO2，37℃条件下，用含 10%小牛血清、1% L-
谷氨酰胺、100U·ml
至 70～80%融合时 ,用 0.25%胰酶消化传代继续培养。
3. MTT 法检测 Res 处理后 MIAPaCa-2 细胞的增殖抑制率
胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞用 0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为 1×10
重新接种到 96 孔培养板，约 1×10
胞约 70%融合。然后，将细胞分 Res 处理组、溶剂对照组及空白对照组：Res 组
分别换用含不同浓度 Res(25 umol/L、50 umol/L、100 umol/L、200 umol/L)的
培养液 100μl；溶剂对照组换用 100μl 含与 Res 相应浓度 DMSO 的培养液；含
100μl 培养液(不含细胞与药物)孔板作为空白对照组,浓度选择参照文献[6]。每
组设 3 复孔。培养 48hr 后，加入 MTT(5mg/ml)20μl/孔，继续培养 4hr 后，去
上清，加入 DMSO 100 μl/孔，室温振荡 10 min，上酶标免疫测定仪检测，492nm
波长测定吸光度值(absorbance ,A)。比色时，空白组调零。计算细胞增殖抑制
率，抑制率=(1-处理组 A/溶剂对照组 A)×100%。以上实验重复 3 次。
4.流式细胞仪检测细胞周期的改变
胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞用 0.25%胰酶消化后，重新接种到 6 孔培养板，37
过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约 70%融合。将细胞分 Res 组和对照组：Res
组换用含不同浓度 Res(25 umol/L、50 umol/L、100 umol/L、200 umol/L)的培
养液，对照组含不加药物细胞培养液。5%CO2, 37℃条件下分别继续培养 48hr
后，收集对照组、25 umol/L、50 umol/L、100 umol/L、200 umol/L Res 处理
组细胞(≥1×10 multicycle 软件分析结果。
5.统计学处理
实验数据均用平均数±标准差 (x±S)表示，组间多样本均数的多重比较采
用单因素方差分析和 LSD-t 检验，用 SPSS 10.0软件分析结果,P<0.05 表示有统
计学意义。
6
)，加预冷 70%乙醇固定过夜，用 PI 染色。上流式细胞仪检测，
结 果
1. MTT 比色法检测细胞增殖抑制率分别用 25umol/L、50 umol/L、100 umol/L、200 umol/L 处理 MIAPaCa-2细胞 48hr 后，酶标仪测定 A 值结果后,计算增殖抑制率，25umol/L Res处理 48hr后，平均抑制率即达 12.80%，随着药物浓度增加，细胞增殖抑制率不断提高，具体结果见表 1。用单因素方差分析和 LSD-t 检验对不同浓度组样本均数进行两两多重比较，统计结果分析为：F=293.277,P=0.000，不同浓度组之间抑制率均有显著性差异(P<0.05)。换言之， Res 体外对 MIAPaCa-2 细胞有显著抑制作用,
且在一定范围内呈浓度依赖性。
2. 流式细胞仪示细胞周期的改变
不同浓度 Res 分别处理 48hr 后，流式细胞仪检测细胞周期分布，结果见表
2 与图 1。用单因素方差分析分别对 G0/G1 期、S 期、G2/M 各组间样本均数差异
进行分析， 得 F 值和 P 值分别为 F=26.953,P=0.000; F=47.994 ,P=0.000;
F=1.526 ,P=0.267;根据统计结果认为 G0/G1 期和 S 期各组间均数存在差异，尚
不能认为 G2/M 期各组间均数存在差异，然后用 LSD-t 检验分别对 G0/G1 期、S
期各组间样本均数行两两间多重比较，结果示：随着药物作用浓度增大，G0/G1
期细胞比例随浓度依赖性减少，S 期细胞比例随浓度依赖性增大，具体见表 2。
讨 论
Res 的化学名为芪三酚(3,5，4'-trihydroxystibene),分子式 C14H12O3，相对分子量 228.25，属于非黄酮 类多酚化合物 ，于 1940 年首次从毛叶 藜芦(veratrumgrandiflorum)的根部分离获得。其结构式有顺、反式两类，均能与葡萄糖结合，形成顺式或反式白藜芦醇甙，它们与 Res 一样具有生物学活性[7]。近年来的研究发现，Res 广泛存在多种植物中，以中药植物虎杖中含量较为丰富 。
研究还证实，Res 是植物在不利条件下，如紫外线照射、真菌感染、以及机械性损伤所产生的“植物补体”，它对植物本身起保护作用，对人体也具有调节脂类代谢、防止低密度脂蛋白氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、保护心脑血管和抗炎、抗过敏与抗肿瘤等多种药理作用[8]。而且,Res 为天然化合物,无毒副作用,故其药用价值极大，已引起了全世界科研人员的高度关注。本研究通过观察 Res体外对胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞增殖和细胞周期分布的影响,旨在进一步认识该药的药理作用，为进一步利用开发该类药物提供实验依据。
肿瘤对药物敏感的实验分为体内实验和体外实验两种，体外实验是体内实验的基础，体外实验的常用方法有 MTT 法，克隆形成实验，三磷酸腺苷生物发光法，放射性同位素掺入核苷酸前体物试验法等。其中 MTT 法具有操作简便,快捷,设备简单,结果重复性好,成功率高等优点,近年来被广泛应用于体外药物敏感度的检
测 [9]。
其主要原理[10]：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲月替(formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，DMSO 能溶解细胞中的紫色晶体物，用酶标免疫测定仪在此基础上于一定范围波长处测定其光吸收值,可间接反应活细胞数。在一定细胞数范围内，MTT 结晶物数量与细胞数成正比。本实验通过 MTT 法检测到 Res 对 MIAPaCa-2 细胞有显著增殖抑制作用，25μmol/L Res对胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞增殖抑制作用已经相当明显，作用 48hr 平均抑制率已达 12.80%；当浓度提高到 200μmol/L 时，作用48hr其平均抑制率分别为58.70%,Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞的增殖抑制作为了探讨Res体外对MIAPaCa-2细胞的增殖抑制作用与细胞周期分布的关系,
本实验用流式细胞式对Res处理后细胞周期进行分析,结果发现:Res处理后,细胞
[11]等研究发现Res能使前列腺癌细胞G1期比例减少，同时增加S期细胞比例，与同报道结果相似，但亦有报道发现Res可同时上调肝癌细胞G2/M期与S期细胞比例[12]。可见Res对肿瘤细胞周期分布的影响因肿瘤类型或细胞类型存在差异，其机制仍待下一步的研究。
综上所述，Res体外可抑制胰腺癌MIAPaCa-2细胞的增殖，引起细胞周期重新分布是其主要机制之一。Res有望成为治疗胰腺癌的新药，但其具体效果仍待进一步的体内实验和临床试验加以验证。
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